Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств. ХХ. Оценка предела количественного определения по стандартному отклонению сигнала и наклону градуировочной кривой. I. Общие положения

(ОФС 42-0113-09)

Валидация (validation) – это процесс экспериментального подтвержде-

ния того, что аналитическая методика обеспечивает получение необходимой и достоверной информации об объекте анализа и пригодна для практ ического использования.

Настоящая общая фармакопейная статья регламентирует характеристи-

ки аналитических методик, определяемые с целью их валидации, и соответ-

ствующие критерии пригодности валидируемых методик, предназначенных для контроля качества лекарственных средств: субстанций и препаратов.

Валидации подлежат методики количественного определения, в том чис-

ле методики определения примесей. Методики проверки подлинности подвер-

гаются валидации при необходимости подтвердить их специфичность.

При валидации проводится оценка аналитической методики по перечис-

ленным ниже характеристикам, выбираемым с учетом рекомендаций табл.15.1:

– специфичности (specificity);

– пределу обнаружения или чувствительности (detection limit ) ;

– пределу количественного определения (quantitation limit);

– аналитической области (range);

– линейности (linearity ) ;

– правильности (trueness);

– прецизионности (precision);

– устойчивости (robustness).

Таблица 15.1 Характеристики методики, определяемые при валидации

*) может определяться при необходимости;**) отсутствие специфичности одной аналитической методики может быть компен-

сировано использованием другой аналитической методики

Ревалидацию (повторную валидацию) методик проводят при:

– изменении технологии получения объекта анализа;

– изменении состава лекарственного средства (объекта анализа);

– изменении ранее утвержденной методики анализа.

1. СПЕЦИФИЧНОСТЬ

С пецифичность – это способность аналитической методики давать пра-

вильный результат определения вещества в присутствии сопутствующих компо-

Доказательство специфичности валидируемой методики обычно осно-

вывается на рассмотрении полученных с ее использованием данных анализа модельных смесей известного состава.

Специфичность валидируемой методики может быть доказана также соответствующей статистической обработкой результатов анализов реальных объектов, выполненных с ее использованием и, параллельно, с использовани-

ем другой, заведомо специфичной, методики.

1.1. Для методик испытаний на подлинность

Валидируемая методика (или совокупность методик) должна обеспечи-

вать достоверную информацию о присутствии данного лекарственного веще-

ства в субстанции или лекарственной форме при наличии в ее составе преду-

смотренных рецептурой компонентов, что подлежит экспериментальному подтверждению.

1.2. Для методик количественного определения

Для валидируемой методики количественного определения должна быть оценена ее специфичность в отношении определяемого вещества, т. е.

должно быть экспериментально подтверждено, что присутствие сопутст-

вующих веществ не влияет непредусмотренным образом на результат анали-

Допускается оценка специфичности валидируемой методики как путем анализа модельных смесей известного состава, содержащих определяемое вещество, так и путем сравнения результатов анализов реальных объектов,

полученных одновременно с использованием валидируемой и другой, заве-

домо специфичной методики. Результаты соответствующих экспериментов должны быть статистически обработаны.

При валидации методик, если это целесообразно, могут использоваться образцы лекарственных средств, подвергнутые, с целью накопления в них примесей, воздействию экстремальных условий (света, температуры, влаж-

ности) или химически модифицированные любым подходящим способом.

2. ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ

Предел обнаружения – это наименьшее количество (концентрация) оп-

ределяемого вещества в пробе, которое может быть хотя бы приближенно оценено с использованием валидируемой методики.

Предел обнаружения в случаях, указанных в табл. 15.1, обычно выража-

ется как концентрация определяемого вещества (в % отн. или долях на миллион

– ppm).

В зависимости от типа методики (визуальная или инструментальная)

используют разные способы определения предела обнаружения:

2.1. Для методик с визуальной оценкой результата анализа

(концентрациями) определяемого вещества и устанавливают минимальное значение, при котором результат анализа может быть оценен визуально. Это значение является оценкой предела обнаружения.

2.2. Для методик с инструментальной оценкой результата анализа

2.2.1. По соотношению сигнал/шум

Устанавливают минимальное количество (концентрацию) определяе-

мого вещества в пробе, при котором величина отношения аналитического сигнала к уровню шумов находится в пределах от 3 до 5. Найденная величи-

на является оценкой предела обнаружения.

2.2.2. По величине стандартного отклонения сигнала иугловому коэффициенту калибровочного графика

Предел обнаружения (ПО) находят по уравнению:

ПО = 3,3 × S /b

ченное значение ПО при необходимости может быть подтверждено прямым экс-

периментом при количествах (концентрациях) определяемого вещества, близких к найденному значению ПО.

Как правило, если имеются данные о пригодности методики для на-

дежного определения вещества в концентрациях, лежащих как выше, так и ниже нормы его содержания, установленной спецификацией, определять ре-

альный предел обнаружения для такой методики не требуется.

3. ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Предел количественного определения – это наименьшее количество

(концентрация) вещества в образце, которое может быть количественно оце-

нено с использованием валидируемой методики с требуемой правильностью и внутрилабораторной (промежуточной) прецизионностью.

Предел количественного определения является необходимой валидацион-

ной характеристикой методик, используемых для оценки малых количеств (кон-

центраций) веществ в образце и, в частности, для оценки содержания примесей.

В зависимости от типа методики используют следующие способы на-

хождения предела количественного определения.

3.1. Для методик с визуальной оценкой результата анализа

Проводят испытания образцов с различными известными количествами

(концентрациями) анализируемого вещества и устанавливают минимальное значение, при котором результат анализа может быть получен визуально с требуемой правильностью и внутрилабораторной (промежуточной) прецизи-

онностью.

3.2. Для методик с инструментальной оценкой результата анализа

3.2.1. По соотношению сигнал/шум

Устанавливают минимальную концентрацию определяемого вещества

в пробе, при которой величина отношения аналитического сигнала к уровню

3.2.2. По величине стандартного отклонения сигнала и угловому коэффициенту калибровочного графика

Предел количественного определения (ПКО) рассчитывают по уравнению:

ПКО = 10 × S /b

где: S – стандартное отклонение аналитического сигнала;

b – коэффициент чувствительности, представляющий собой отношение аналитического сигнала к определяемой величине.

При наличии экспериментальных данных в широком диапазоне изме-

ряемой величины S иb могут быть оценены методом наименьших квадратов.

Для линейного калибровочного графика значение S принимают равным стандартному отклонениюS a свободного члена уравнения этого графика. Полу-

ченное значение ПКО при необходимости может быть подтверждено прямым экспериментом при количествах (концентрациях) определяемого вещества, близ-

ких к найденному значению ПКО.

Если имеются данные о способности методики надежно определять анализируемое вещество в концентрации выше и ниже установленной в спе-

цификации нормы его содержания, определять реальное значение ПКО для такой методики, как правило, не требуется.

4. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ МЕТОДИКИ

Аналитическая область методики – это интервал между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента в объекте анализа (его количества, концентрации, активности и т. п.). В этом интервале получаемые с использованием валидируемой методики результаты должны иметь приемлемый уровень правильности и внутрилабораторной

(промежуточной) прецизионности.

К величине аналитической области методик предъявляются следующие требования:

– методики количественного определения должны быть применимы в интервале от 80 до 120 % от номинального значения определяемой аналити-

ческой характеристики;

– методики оценки однородности дозирования должны быть примени-

мы в интервале от 70 до 130 % от номинальной дозы;

– методики количественного определения, используемые при проведе-

нии теста «Растворение», обычно должны быть применимы в пределах от 50

до 120 % от ожидаемой концентрации действующего вещества в среде рас-

творения;

– методики испытаний на чистоту должны быть применимы в откры-

том интервале от «Предела количественного определения» или «Предела об-

наружения» до 200 % отн. от допустимого содержания определяемой приме-

Аналитическая область методики может быть установлена по диапазо-

ну экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели.

5. ЛИНЕЙНОСТЬ

Линейность методики – это наличие линейной зависимости аналитиче-

ского сигнала от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики.

При валидации методики ее линейность в аналитической области про-

веряют экспериментально измерением аналитических сигналов для не менее чем пяти проб с различными количествами или концентрациями определяе-

мого вещества. Экспериментальные данные обрабатывают методом наи-

меньших квадратов с использованием линейной модели y =b × x +a (х – ко-

личество или концентрация определяемого вещества; y – величина отклика;b – угловой коэффициент;a – свободный член), как указано в ОФС «Стати-

стическая обработка результатов химического эксперимента». При матема-

тической обработке рассчитывают величину коэффициента корреляции r . В

аналитической химии в большинстве случаев используют линейные зависи-

мости, отвечающие условию r 0,99, и только при анализе следовых коли-

иных подтверждений высокой вероятности линейной связи между перемен-

ными x иy не требуется. Необходимо отметить, что доверительные интерва-

лы определяемых при анализе величин лежат в пределах 2 % отн. при степе-

ни надежности, равной 0,05, лишь тогда, когда r 0,9995.

В отдельных случаях возможность линейной аппроксимации экспери-

ментальных данных обеспечивается лишь после их математического преобра-

зования (например, логарифмирования).

Для некоторых методик анализа, в основу которых в принципе не мо-

жет быть положена линейная зависимость между экспериментальными дан-

ными, определение концентрации или количества вещества проводят с ис-

пользованием нелинейных калибровочных графиков. При этом график зави-

симости аналитического сигнала от количества или концентрации опреде-

ляемого вещества может быть аппроксимирован подходящей нелинейной функцией с использованием метода наименьших квадратов, что выполнимо при наличии соответствующего программного обеспечения.

6. ПРАВИЛЬНОСТЬ

Правильность методики характеризуется отклонением среднего резуль-

тата определений, выполненных с ее использованием, от значения, прини-

маемого за истинное.

Валидируемая методика признается правильной, если значения, при-

нимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответст-

вующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике.

С учетом сказанного для оценки правильности методик количественно-

го определения применимы следующие подходы:

а) анализ с использованием валидируемой методики стандартных об-

разцов или модельных смесей с известным содержанием (концентрацией)

определяемого вещества;

б) сравнение результатов, полученных с использованием валидируемой методики и образцовой методики, правильность которой ранее установлена;

в) рассмотрение результатов изучения линейности валидируемой мето-

дики: если свободный член в уравнении, приведенном в разделе 5, статисти-

чески достоверно не отличается от нуля, то использование такой методики дает результаты, свободные от систематической ошибки.

Для подходов «а» и «б» возможно представление полученных данных в виде уравнения линейной зависимости (регрессии) между экспериментально найденными и истинными величинами. Для этого уравнения проверяются гипотезы о равенстве единице тангенса угла наклона b и о равенстве нулю свободного членаa . Как правило, если эти гипотезы признаются верными при степени надежности, равной 0,05, то использование валидируемой методики дает правильные, т. е. свободные от систематической ошибки, результаты.

7. ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Прецизионность методики характеризуется рассеянием результатов,

получаемых с ее использованием, относительно величины среднего результа-

та. Мерой такого рассеяния является величина стандартного отклонения ре-

зультата отдельного определения, полученная для выборки достаточно большого объема.

Прецизионность оценивается для любой методики количественного определения по результатам не менее 3 определений для каждого из 3 уров-

ней определяемых величин (нижнего, среднего и верхнего), лежащих в пре-

делах аналитической области методики. Во многих случаях оценка прецизи-

онности может быть проведена по результатам обработки эксперименталь-

ных данных методом наименьших квадратов, как указано в ОФС «Статисти-

ческая обработка результатов химического эксперимента».

Прецизионность должна исследоваться на однородных образцах и мо-

жет оцениваться в трех вариантах:

– как повторяемость (сходимость);

– как внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность;

– как межлабораторная прецизионность (воспроизводимость).

Результаты оценки методики анализа по каждому из вариантов преци-

зионности обычно характеризуются соответствующим значением величины стандартного отклонения результата отдельного определения с указанием числа степеней свободы.

Обычно при разработке оригинальной методики определяется повторяе-

мость (сходимость) результатов, получаемых с ее использованием. При необхо-

димости включения разработанной методики в нормативную документацию дополнительно определяется ее внутрилабораторная (промежуточная) прецизи-

онность. Межлабораторная прецизионность (воспроизводимость) методики оценивается при предполагаемом ее включении в проект ОФС, ФС или в нор-

мативную документацию на государственные стандартные образцы.

7.1. Повторяемость (сходимость)

Повторяемость аналитической методики оценивают по независимым результатам, полученным в одинаковых условиях в одной лаборатории (один и тот же исполнитель, одно и то же оборудование, один и тот же набор реак-

тивов) в пределах короткого промежутка времени.

7.2. Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность

Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность валидируемой методики оценивается в условиях работы одной лаборатории (разные дни,

разные исполнители, разное оборудование и т. д.).

7.3. Межлабораторная прецизионность (воспроизводимость)

Межлабораторная прецизионность (воспроизводимость) валидируемой мето-

дики оценивается при проведении испытаний в разных лабораториях.

8. УСТОЙЧИВОСТЬ

Устойчивость валидируемой методики – это способность сохранять найденные для нее в оптимальных (номинальных) условиях характеристики,

приведенные в таблице 15.1, при вероятных небольших отклонениях от этих условий проведения анализа.

Устойчивость методики не следует определять по отношению к легко контролируемым условиям проведения анализа. Это резко сокращает необ-

ходимость в специальном изучении устойчивости.

Устойчивость должна изучаться только в тех случаях, когда валиди-

руемая методика основана на использовании особо чувствительных к внеш-

ним условиям методов анализа, таких как различные виды хроматографии и функционального анализа. При необходимости оценка устойчивости методи-

ки проводится на стадии ее разработки. Если вероятна невысокая устойчи-

вость методики, проверка ее пригодности осуществляется в обязательном порядке непосредственно в процессе практического использования.

Проверка пригодности аналитической системы

Проверка пригодности аналитической системы – это проверка выпол-

нения основных требований, предъявляемых к ней. Система, пригодность ко-

торой проверяется, представляет собой совокупность конкретных приборов,

реактивов, стандартов и анализируемых образцов. Требования к такой систе-

ме обычно конкретизированы в ОФС на соответствующий аналитический метод. Таким образом, проверка пригодности аналитической системы стано-

вится процедурой, включаемой в валидируемую методику.

Представление результатов валидации

Протокол валидации аналитической методики должен содержать:

– ее полное описание, достаточное для воспроизведения и отражающее все условия, необходимые для выполнения анализа;

– результаты статистической обработки данных, полученных экспери-

ментально при разработке или проверке валидируемой методики;

– иллюстративные материалы, такие как копии хроматограмм, полу-

ченных методами ВЭЖХ или ГХ; копии электронных и ИК-спектров; фото-

графии или рисунки хроматограмм, полученных методами тонкослойной или бумажной хроматографии; рисунки кривых титрования;

– заключение о пригодности валидируемой методики для включения в нормативный документ (ФСП, ФС и т. п.).

Материалы валидации отдельных аналитических методик, включаемых в проект нормативного документа, целесообразно представлять в виде объе-

диненного отчета о валидации.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

16. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ (ОФС 42-0114-09)

В настоящей статье изложены общие принципы определения витами-

нов в субстанциях и лекарственных формах с использованием методов ВЭЖХ, спектрофотометрии и титриметрии.

Приведенные типовые методики позволяют количественно определять следующие соединения: витамин А (ретинол, ретинола ацетат и ретинола пальмитат), витамин D (холекальциферол и эргокальциферол), витамин Е

(-токоферол и - токоферола ацетат), витамин К1 (фитоменадион),

Каротин, витамины группы В: В1 (тиамина хлорид, тиамина бромид и тиа-

мина мононитрат), В2 (рибофлавин, рибофлавинмононуклеотид), В3 (кислоту пантотеновую и ее соли, пантенол), В5 (кислоту никотиновую, никотинамид),

В6 (пиридоксина гидрохлорид), ВС (кислоту фолиевую), В12 (цианокобала-

мин), витамин С (кислоту аскорбиновую или ее натриевую или кальциевую соли, аскорбилпальмитат), d- биотин, рутин.

1. ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Жидкостной хроматограф, снабженный спектрофотометрическим де-

тектором с переменной длиной волны для ультрафиолетовой и видимой об-

теоретических тарелок. Инжектируемый объем 20 мкл. Скорость потока под-

вижной фазы 1,0 мл/мин.

Допускается использование колонок других размеров с той же или большей эффективностью, а также других объемов инжектирования и скоро-

стей потока подвижной фазы при условии пригодности хроматографической системы.

Показатели пригодности хроматографической системы. Разрешение

двух соседних пиков должно быть больше 1,5.

Факторы асимметрии пиков должны быть близки к единице, в предель-

ном случае не больше 2.

Проведение расчетов. Содержание витамина в анализируемой субстан-

ции в процентах (Х 1 ) или в анализируемом препарате в миллиграммах (Х 2 )

вычисляют по формулам:

где: S иS 0 – площади пиков определяемого витамина на хроматограммах испытуемого и стандартного растворов соответственно;

а – навеска испытуемого препарата или субстанции, в граммах;

N иN 0 – разведения при приготовлении испытуемого и стандартного растворов соответственно;

G – среднее значение массы единицы лекарственной формы, в миллиграммах.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ

2.1. Определение витаминов А, D и Е в любых препаратах

Подвижная фаза: метанол – ацетонитрил (80:20).

Витамин А – от 0,5 до 3,5 мкг/мл;

Витамин D – от 2 до 10 мкг/мл;

Витамин Е – от 1 до 5 мг/мл

Приготовление стандартных растворов.

риваемой группы, содержащихся в этом препарате. Количества стандартных

образцов ретинола ацетата, холекальциферола (или эргокальциферола) и- токоферола ацетата (точные навески), примерно эквивалентные количеству этих витаминов, содержащихся в 1 таблетке (капсуле, дозе сиропа, геля или раствора), помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 мл. Туда же помещают кислоту аскорбиновую в количестве примерно 10:1 по отношению к навеске - токоферола ацетата. В колбу добавляют 15 мл воды и нагревают на водяной бане при 60 С в течение 5 мин. Затем добавляют 25 мл спирта

96 % и 8 мл 50 % водного раствора калия гидроксида и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 60 С в течение 30 мин. Полученную смесь охлаждают и экстрагируют гексаном (3 раза по 50 мл). Объединенные гексановые экстракты промывают водой до нейтральной реакции водного слоя по универсальной индикаторной бумаге и упаривают на роторном испа-

рителе при температуре не выше 60 С. Остаток после упаривания растворя-

ют в 25,0 мл подвижной фазы. При необходимости используют другое разве-

дение для получения приемлемых для конкретных условий анализа концен-

траций витаминов.

При анализе субстанций готовят стандартные растворы с концентраци-

Растирают 10 таблеток (со-

держимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, примерно равную массе одной таблетки или содержимого одной капсулы. Навеску помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 мл. Если в испытуемом образце со-

держится - токоферола ацетат, но отсутствует аскорбиновая кислота, туда же помещают аскорбиновую кислоту в количестве примерно 10:1 по отно-

шению к навеске - токоферола ацетата. При анализе жидких или гелеобраз-

ных образцов берут точную навеску, примерно равную массе одной дозы препарата. К навеске добавляют 15 мл воды и нагревают на водяной бане при

60 С в течение 5 мин. Затем добавляют 25 мл спирта 96 % и 8 мл 50 % вод-

ного раствора калия гидроксида и нагревают на водяной бане с обратным хо-

лодильником при 60 С в течение 30 мин. Полученную смесь охлаждают и экстрагируют гексаном (3 раза по 50 мл). Объединенные гексановые экстрак-

ты промывают водой до нейтральной реакции и упаривают на роторном ис-

парителе при температуре не выше 60 С. Остаток после упаривания раство-

ряют в 25,0 мл подвижной фазы. При необходимости используют другое раз-

ведение для получения приемлемых в конкретных условиях анализа концен-

траций витаминов.

При анализе субстанций готовят испытуемые растворы с концентраци-

ей определяемых витаминов в указанных выше пределах.

При анализе масляных растворов приготовление испытуемого раствора проводят аналогичным образом с той только разницей, что воду (10 мл) до-

бавляют через обратный холодильник не до, а после омыления, т. е. после на-

гревания смеси на водяной бане при 60 С.

Проведение анализа. Последовательно хроматографируют стандартный и испытуемый растворы. Операцию повторяют не менее двух раз.

Условия детектирования определяются составом анализируемого пре-

парата и используемым оборудованием.

При использовании интегратора определение каждого витамина можно проводить отдельно, детектируя витамин А при 326 нм, витамин Е при 292

нм и витамин D при 265 нм. Возможно также одновременно определять ви-

тамины А и Е, проводя детектирование при 300 нм.

При использовании компьютерных программ для регистрации и обра-

ботки данных все три витамина могут быть определены одновременно на од-

ной хроматограмме при длине волны детектирования 300 нм.

Примерное соотношение времен удерживания витамин А: витамин D: : витамин Е = 0,35: 0,87: 1.

2.2. Определение витаминов A и Е в масляных растворах,

Количество препарата, соответствующее примерно 0,2 дозы (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 1 мл метиленхлорида, доводят объем раствора метанолом до метки и перемеши-

вают. Полученный раствор анализируют, как указано в разделе 2.1. «Прове-

дение анализа».

2.3. Спектрофотометрическое определение ретинола ацетата и ретинола пальмитата в масляных растворах

Точную навеску препарата, указанную в частной фармакопейной статье

(эквивалентную примерно 9 мг ретинола ацетата или 14 мг ретинола пальми-

тата), помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в спирте изопропиловом, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Полученный раствор разбавляют спиртом изопропиловым до получения раствора с концентрацией 3,0–3,5 мкг/мл для ретинола ацетата и

5,0–5,5 мкг/мл для ретинола пальмитата.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофо-

тометре при длинах волн 300, 326, 350 и 370 нм в кювете с толщиной слоя

10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт изопропиловый.

Вычисляют отношения значений оптической плотности при 300, 350 и 370 нм к значению оптической плотности при 326 нм. Отношения не дол-

жны превышать 0,608 при 300 нм, 0,553 при 350 нм и 0,142 при 370 нм.

При выполнении этого условия содержание ретинола ацетата или паль-

митата в 1 мл препарата в граммах (X ) вычисляют по формуле:

A × ρ× N

ρ – плотность препарата, в г/см 3 ;

Если указанное условие не выполняется, количественное определение

необходимо проводить методом ВЭЖХ (см. п. 2.1).

Примечания

1. 1 г транс -ретинола ацетата соответствует 2907000 ME витамина А. 1 г транс -ретинола пальмитата соответствует 1817000 ME витамина А.

2. Спирт изопропиловый (2-пропанол) при измерении относительно воды в кювете с толщиной слоя 10 мм должен иметь величину оптической плотности, не превышающую 0,01 в области от 320 до 350 нм и 0,05 в области от 280 до 300 нм.

2.4. Определение витамина К1

Около 0,06 г стандартного

образца фитоменадиона (точная навеска) помещают в мерную колбу вмести-

мостью 25 мл, добавляют 10 мл метанола и после растворения доводят объем

до метки тем же растворителем. 1,0 мл полученного раствора переносят в

мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора метанолом до

метки и перемешивают.

Приготовление испытуемого раствора. Навеску измельченного препа-

рата (или аналогичное по содержанию определяемого витамина количество

жидкого препарата), соответствующую примерно 60 мкг фитоменадиона,

помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 15 мл метанола,

выдерживают в течение 5 мин при 60 С, быстро охлаждают до комнатной

температуры, доводят объем раствора метанолом до метки и перемешивают.

При необходимости фильтруют через фильтр с размером пор 0,5 мкм.

При анализе субстанции витамина К1 испытуемый раствор готовят так

же, как стандартный раствор.

Проведение анализа. Подвижная фаза: метанол – метиленхлорид (92:8).

Скорость элюирования 1 мл/мин. Последовательно хроматографируют стан-

дартный и испытуемый растворы в тех же условиях, что и витамины А, D и Е

(см. п. 2.1). Детектирование при 248 нм.

2.5. Определение -каротина

трофотометрически после его экстракции.

Количество препарата, соответствующее примерно 300 мкг -каротина

(точная навеска), экстрагируют 10 мл диметилсульфоксида при встряхивании в течение 10 мин и выдерживают на водяной бане в течение 15 мин при

55 С. Быстро охлаждают до комнатной температуры, переносят в цилиндр с притертой пробкой, прибавляют 25 мл гексана, 3 мл воды и встряхивают в течение 2–3 мин. После разделения слоев 3,0 мл экстракта (верхнего слоя)

переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора гек-

саном до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность получен-

ного раствора в максимуме поглощения при длине волны 450 нм относитель-

но гексана.

где: А – оптическая плотность испытуемого раствора;

N – разведение испытуемого раствора;

G – средняя масса единицы лекарственной формы;

а – навеска испытуемого препарата; 1650000 – активность 1 г -каротина, МЕ;

A 1 1% см – удельный показатель поглощения -каротина в гексане при длине волны 450 нм, равный 2592.

Анализ концентратов и субстанции -каротина выполняют аналогич-

ным образом.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ

Все водорастворимые витамины (за исключением витамина С в неко-

торых случаях) определяют методом высокоэффективной жидкостной хро-

матографии (см. раздел 1).

3.1. Определение витаминов В1 , В2 , В5 , В6 , ВС , С и рутина

Витамин В1 : от 5 до 15 мкг/мл;

Витамин В2 : от 3 до 8 мкг/мл;

Витамин В5 (никотинамид и никотиновая кислота): от 2 до 5 мкг/мл;

Витамин ВС (фолиевая кислота): от 3 до 8 мкг/мл;

Витамин В6 : от 5 до 10 мкг/мл;

Витамин С: от 150 до 300 мкг/мл;

Рутин: от 100 до 200 мкг/мл.

Приготовление подвижной фазы. Раствор А: 0,240 г натрия пентан-

сульфоната и 5 мл уксусной кислоты ледяной растворяют в смеси метанол

– вода (25:75), переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят об ъ-

ем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор Б: 0,275 г натрия гептансульфоната и 5 мл уксусной кислоты ледяной растворяют в смеси метанол – вода (25:75), переносят в мерную кол-

бу вместимостью 250 мл, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Для получения подвижной фазы смешивают растворы А и Б в соотно-

Приготовление стандартного раствора. В зависимости от состава анализируемого препарата готовят стандартный раствор витаминов рассмат-

риваемой группы, содержащихся в этом препарате. Точные навески стан-

дартных образцов витаминов В1 , В2 , В6 , никотинамида, Вс (фолиевой кисло-

ты), С, рутина, примерно равные содержанию этих витаминов в 1 таблетке

(капсуле, дозе) анализируемого препарата, помещают в мерную колбу вме-

стимостью 50 мл, добавляют 20 мл подвижной фазы, нагревают в течение

20 мин на водяной бане при 60 С, охлаждают до комнатной температуры,

доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают.

Приготовление испытуемого раствора. Растирают 10 таблеток (со-

держимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, примерно равную массе одной таблетки или содержимого одной капсулы. При анализе жид ких или гелеобразных образцов берут точную навеску, примерно равную массе одной дозы препарата. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью

чиная со слов «добавляют 20 мл подвижной фазы». При необходимости ис-

пользуют другое разведение для получения приемлемых для конкретных ус-

ловий анализа концентраций витаминов.

Проведение анализа. Последовательно хроматографируют предвари-

тельно отфильтрованные через фильтр с размером пор 0,5 мкм стан дартный и испытуемый растворы, проводя детектирование при 280 нм. Операцию по-

вторяют не менее двух раз. Относительные времена удерживания рутин: ви-

тамин В1 : витамин В2 : витамин ВС : витамин В6 : витамин В5 : витамин С

1: 0,45: 0,30: 0,25: 0,21: 0,12.

3.1.1. Определение рутина отдельно от других водорастворимых витаминов

Для уменьшения времени удерживания рутина используют подвижную фазу состава метанол – вода (44,5:55,5) с рН 2,4 (рН устанавливают, добавляя по каплям разбавленный раствор фосфорной кислоты). Остальные операции проводят аналогично п. 3.1 с той только разницей, что нагревание на в одяной бане при 60 С проводят в течение 5 мин. Время удерживания рутина около

3.2. Определение витамина В3

Подвижная фаза: 0,05 М раствор калия фосфата однозамещенного

(рН 2,8) – метанол (95:5).

Приготовление стандартного раствора. Готовят раствор стандартно-

го образца витамина В3 (пантотеновой кислоты, пантотената кальция или пантенола) в подвижной фазе с концентрацией около 200 мкг/мл в расчете на пантотеновую кислоту.

Приготовление испытуемого раствора. Точную навеску порошка рас-

тертых таблеток (содержимого капсул, жидкого или гелеобразного препара-

та), эквивалентную 10 мг витамина В3 , помещают в мерную колбу вместимо-

стью 50 мл, добавляют 20 мл подвижной фазы, встряхивают 2–3 мин, дово-

дят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают.

Проведение анализа.

ный и испытуемый растворы, проводя детектирование при 205 нм. Осталь-

ные условия указаны в разделе 1. Операцию повторяют не менее 2-х раз.

Время удерживания витамина В3 около 8,5 мин.

3.3. Определение витамина В12

Методика 1

Подвижная фаза: метанол – вода (65:35).

Приготовление стандартного раствора. Готовят раствор стандартного образца цианокобаламина в воде, имеющий концентрацию около 0,5 мкг/мл.

Приготовление испытуемого раствора. Растирают 10 таблеток (со-

держимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, эквивалентную примерно 10 мкг цианокобаламина (при анализе жидких или гелеобразных образцов отбирают точный объем или берут точную навеску, в которых со-

держание цианокобаламина примерно равно его содержанию в одной дозе препарата). Навеску помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, до-

бавляют 20,0 мл воды и энергично встряхивают 2–3 мин. Раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,5 мкм, отбрасывая первые 5 мл фильтрата (в

случае жидких образцов раствор тщательно перемешивают).

Проведение анализа.

ный и испытуемый растворы, проводя детектирование при 550 нм. Операцию повторяют не менее 2-х раз. Время удерживания витамина В12 около 5 мин.

Методика 2

Подвижная фаза: 1 % раствор динатрия гидрофосфата безводного

(рН 3,5) – метанол (30:70).

Приготовление стандартного раствора. Готовят раствор стандартного образца цианокобаламина в воде с концентрацией около 0,5 мкг/мл.

Приготовление испытуемого раствора. Растирают 10 таблеток (со-

держимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, эквивалентную примерно 10 мкг цианокобаламина (при анализе жидких или гелеобразных образцов отбирают точный объем или берут точную навеску с содержанием цианокобаламина, примерно равным его содержанию в одной дозе препара-

та). Добавляют 20,0 мл подвижной фазы и встряхивают в течение 5 мин. По-

лученный раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,5 мкм, отбрас ы-

вая первые 5 мл фильтрата (в случае жидких образцов раствор тщательно пе-

ремешивают).

Проведение анализа. Инжектируемый объем не менее 50 мкл. Остальные условия указаны в разделе 1. Последовательно хроматографируют стандарт-

ный и испытуемый растворы, проводя детектирование при 361 нм. Операцию повторяют не менее 2-х раз. Время удерживания витамина В12 около 5 мин.

Методика 3

Определение методом спектрофотометрии. Готовят раствор препара-

та в воде с концентрацией 20–25 мкг/мл. Измеряют оптическую плотность

полученного раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при

длине волны 361 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО цианокоба-

В качестве раствора сравнения используют воду.

При анализе инъекционных растворов содержание цианокобаламина в

1 мл препарата в микрограммах (X ) вычисляют по формуле:

При анализе субстанций содержание цианокобаламина (Х ) в субстанции

в процентах (Х ) вычисляют по формуле:

Примечания

1. Приготовление раствора СО цианокобаламина. Около 0,05 г (точная навеска) СО цианокобаламина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 80 мл воды, взбалтывают 10 мин, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (раствор А). 2,0 мл полученного раствора

переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Срок годности раствора А – 1 мес. при хранении в защищенном от света месте.

2. При отсутствии СО цианокобаламина можно использовать значение удельного показателя поглощения цианокобаламина при длине волны 361 нм, равное 207.

3.4. Определение d -биотина

Приготовление подвижной фазы . К 1 г натрия перхлората прибавляют

75 мл ацетонитрила и 1 мл фосфорной кислоты; после растворения добавля-

ют воду до 1 л и доводят значение рН до 4,5 добавлением 0,1 М раствора на-

трия гидроксида.

Приготовление стандартного раствора. Готовят раствор стандартного образца d-биотина, имеющий концентрацию около 3 мкг/мл.

Приготовление испытуемого раствора. Растирают 10 таблеток (со-

держимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, примерно экви-

валентную 75 мкг d- биотина. Аналогичную навеску берут при анализе жид-

ких или гелеобразных образцов. Навеску помещают в мерную колбу вмести-

мостью 25 мл, добавляют 15 мл воды, нагревают на водяной бане при 60 С в течение 5 мин, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем рас-

твора водой до метки и перемешивают.

Перед проведением анализа стандартный и испытуемый растворы фильтруют через фильтр с размером пор 0,5 мкм.

При анализе субстанции биотина испытуемый раствор готовят так же,

как стандартный раствор.

Проведение анализа. Последовательно хроматографируют стандарт-

ный и испытуемый растворы на колонке 250 4,6 мм, заполненной октилси-

ланом с размером частиц 5 мкм, проводя детектирование при

200 нм. Остальные условия указаны в разделе 1. Операцию повторяют не ме-

нее трех раз. Время удерживания d- биотина около 20 мин.

3.5. Титриметрическое определение витамина С

Растирают 10 таблеток (содержимое 10 капсул) и отбирают точную на-

веску порошка, примерно эквивалентную 0,1 г аскорбиновой кислоты. При анализе жидких или гелеобразных образцов берут аналогичную навеску. На-

веску помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в

10 мл воды дистиллированной и 10 мл 2 % раствора хлористоводород-

ной кислоты, встряхивая в течение 10 мин. Объем полученного раствора до-

водят водой до метки, перемешивают и фильтруют; первые 10 мл фильтрата отбрасывают. 10,0 мл полученного раствора помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 1 мл 2 % раствора хлористоводородной кислоты, 0,5 мл 1 % раствора калия йодида, 2 мл 0,5 % раствора крахмала,

воду до общего объема 20 мл и титруют 0,00167 М раствором калия йода-

та до появления стойкого светло-синего окрашивания.

1 мл 0,00167 М раствора калия йодата соответствует 0,8824 мг С6 Н8 О6

(аскорбиновой кислоты).

17. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ (ОФС 42-0115-09)

Фермент (E ) – это белок, обладающий каталитическими свойствами в реакции преобразования субстрата (S ) в продукт (P ).

Классификация ферментов

Согласно международной номенклатуре (табл. 17.1), все ферменты подразделяются на 6 классов согласно типам катализируемых ими реакций.

Принадлежностью фермента к тому или иному классу определяются особен-

ности измерения его активности, описываемые в частных фармакопейных статьях.

Принцип, положенный в основу всех методов определения активности фермента (Е ), заключается в регистрации скорости исчезновения субстрата (S ) (то есть вещества, на которое действует фермент) или скорости образования продукта реакции (P ).

Простейшей схемой для описания кинетики ферментативных реакций является, так называемая, двухстадийная схема:

Начальная скорость (υ o ) катализируемой ферментом реакции, на кото-

рой расходом субстрата можно пренебречь, описывается уравнением Миха-

элиса-Ментен (2):

где: V макс =k кат [ E ] 0 – максимальная скорость реакции;

K м – константа Михаэлиса.

Для аллостерических ферментов начальная скорость ферментативной реакции не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен.

Для определения скорости ферментативной реакции через определен-

ные промежутки времени отбирают пробы из реакционной смеси и проводят количественное определение методами, основанными чаще всего на спек-

тральных свойствах субстрата или продукта реакции.

Требования к условиям проведения ферментативной реакции

Ферментативная реакция должна проводиться в строго определенных условиях с учетом следующих факторов.

1. Начальная скорость реакции (υo ). Скорость ферментативной реак-

ции количественно можно измерить по убыли субстрата или по образованию продукта реакции.

Типичные кинетические кривые ферментативной реакции приведены на рис. 17.1. Для каждой ферментативной реакции могут быть подобраны ус-

ловия, при которых начальный участок кривой линеен, т. е. зависимость кон-

центрации образовавшегося продукта или израсходованного субстрата от времени наблюдения имеет прямо пропорциональный характер.

Рис. 17.1. Типичные кинетические кривые ферментативной реакции

А – регистрация по скорости исчезновения субстрата реакции;Б – регистрация по скорости образования продукта реакции

Начальная скорость реакции (υ o ) определяется как тангенс угла наклона линейного участка кривой.

Поскольку длительность прямолинейного участка кинетической кри-

вой от опыта к опыту несколько изменяется, время инкубации (при исполь-

зовании метода отбора проб) должно составлять не более 70 % и не менее

20 % времени соответствующего прямолинейного участка.

2. Концентрация субстрата ([ S ] 0 ). В большинстве случаев зависи-

мость начальной скорости ферментативной реакции (υ o ) от начальной кон-

центрации субстрата (0 ), согласно уравнению Михаэлиса-Ментен (2) опи-

сывается гиперболической функцией (рис. 17.2а ).

V макс

V макс/ 2

Рис. 17.2. Зависимость начальной скорости реакции υ o от начальной концентрации субстрата 0 .

а – ферментативный процесс, подчиняющийся уравнению Михаэлиса-Ментен; б – процесс, для которого характерно ингибирование фермента субстратом; 0 – начальная концентрация субстрата;

нас – насыщающая концентрация субстрата;

опт – оптимальная концентрация субстрата;V макс – максимальная скорость реакции;

К м – константа Михаэлиса

Начальная скорость реакции (υ o ) зависит от начальной концентрации суб-

страта (0 ) вплоть до его насыщающей концентрации. Под насыщающей кон-

центрацией (нас ) понимают такую концентрацию субстрата, при которой на-

чальная скорость реакции практически перестает повышаться при дальнейшем увеличении концентрации субстрата, стремясь к своему предельному значению,

называемому максимальной скоростью реакции V макс (рис. 17.2а ) Отрезок на абсциссе, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собойК м . При проведении ферментативной реакции реакцион-

ная смесь должна содержать такое количество субстрата, которое обеспечит насыщение фермента в течение всего хода определения (количество субстра-

та, взятого для проведения ферментативной реакции, должно быть примерно на 30 % выше насыщающей концентрации).

Если форма кривой зависимости начальной скорости реакции (υ o ) от начальной концентрации субстрата (0 ) отличается от гиперболической, оп-

ределение параметров по уравнению Михаэлиса-Ментен невозможно. Такие отклонения наблюдаются в случае ингибирования или активации фермента субстратом, а также при работе с аллостерическими ферментами. В этом слу-

чае оптимальной концентрацией субстрата является та концентрация, при ко-

торой начальная скорость реакции максимальна (опт ) (точка перегиба на экспериментальной кривой зависимости начальной скорости реакции от на-

чальной концентрации субстрата) (рис. 17.2б ).

После выбора насыщающей концентрации субстрата необходимо про-

В качестве субстратов используются как природные вещества, такие как альбумин, казеин, крахмал, так и синтетические. Природные субстраты ферментов используют большей частью для подтверждения подлинности.

Синтетические субстраты обеспечивают более высокую точность и лучшую воспроизводимость при количественном определении ферментативной ак-

тивности.

3. Концентрация фермента ([ Е ] 0 ). В соответствии с уравнением Ми-

хаэлиса-Ментен начальная скорость ферментативной реакции (υ o ) в подав-

ляющем большинстве случаев линейно зависит от концентрации фермента

(0 ). Выбор оптимальной для каждого метода концентрации фермента осу-

ществляется экспериментально при помощи построения кривой зависимости начальной скорости реакции от концентрации фермента (рис. 17.3).

После выбора начальной концентрации фермента необходимо прове-

рить, сохраняется ли при ней линейная зависимость отt при выбранном значении насыщающей концентрации субстрата.

Рис. 17.3. Зависимость начальной скорости реакции υ 0 от начальной концентрации фермента 0

4. Температура. Особенностью ферментативных реакций является на-

личие колоколообразной зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком интервале температур, которая характеризуется «тем-

пературным оптимумом» реакции. Эта особенность объясняется наложением двух эффектов: возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при достаточно высоких температурах. Обычно фер-

туре (37 ± 0,1) ºС, если не указано иначе в частной фармакопейной статье.

Предварительно каждый из реагентов нагревают до температуры 37 ºС.

5. рН. Типичная кривая, описывающая для большинства ферментов рН-зависимость начальной скорости ферментативной реакции при наличии двух ионогенных групп в активном центре фермента, приведена на рис. 17.4.

pH опт

Рис. 17.4. Зависимость начальной скорости реакции υ0 от значения рН

Определение активности следует проводить при оптимальном значении рН, определенном при выбранных значениях концентрации фермента и на-

сыщающей концентрации субстрата, использовании буферного раствора того состава, который не ингибирует фермент и температуре (37 ± 0,1) ºС, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

После выбора оптимального значения рН необходимо проверить, со-

храняется ли при этом рН линейная зависимость отt при выбранных зна-

чениях концентрации фермента и насыщающей концентрации субстрата.

6. Кофакторы. Существуют ферменты, для проявления каталитиче-

ских свойств которых необходимо присутствие кофакторов – веществ, с по-

мощью которых происходит активация ферментов. Кофакторами могут вы-

ступать один или несколько неорганических ионов, таких как Fe2+ , Mn2+ , Mg2+ , Zn2+ , или комплексная органическая или металлорганическая молекула,

называемая коферментом.

Для определения оптимальной концентрации кофактора следует по-

строить кривую зависимости начальной скорости реакции от начальной кон-

центрации кофактора, аналогичную зависимости начальной скорости реак-

ции от начальной концентрации субстрата, и по этой кривой выбрать насы-

щающую концентрацию кофактора.

После выбора насыщающей концентрации кофактора необходимо про-

верить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [ P ] отt .

Конкретные параметры ферментативной реакции указываются в част-

ных фармакопейных статьях.

Способы детекции

Для количественной регистрации скорости ферментативной реакции используют спектрофотометрические, флуоресцентные и хемилюминесцент-

ные методы детекции, основанные на спектральных свойствах субстрата или продукта реакции, а также электрохимические методы, такие как потенцио-

метрия, амперометрия и др. Для одних видов анализа детекция может прово-

диться непрерывно в ходе реакции, для других – после ее остановки.

Способ остановки ферментативной реакции должен быть указан в част-

ной фармакопейной статье.

Единицы измерения ферментативной активности

Активность фермента измеряется количеством субстрата, преобразо-

ванного в продукт в единицу времени.

Активность ферментов выражается в Международных единицах (МЕ)

или единицах действия (ЕД).

МЕ – это такое количество фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата за 1 мин (или одного микроэквивалента затронутых реакцией групп в тех случаях, когда атакуется более одной группы в каждой молекуле субстрата).

ЕД – это условная единица, величина которой указывается в частных фармакопейной статьях.

Нормируются:

Удельная активность препарата – выражается в единицах фермента-

тивной активности фермента (МЕ или ЕД) на 1 мг препарата или на 1 мг белка (в последнем случае, удельная активность характеризует чистоту пре-

Определение содержания белка в препарате проводят одним из мето-

дов, приведенных в общей фармакопейной статье «Определение белка».

Доза – выражается в единицах ферментативной активности (МЕ или ЕД) на единицу лекарственной формы.

Перевод единиц активности ЕД в МЕ и обратно осуществляется опыт-

ным путем на основании статистически достаточного материала, обработан-

ного по общей фармакопейной статье «Статистическая обработка результа-

тов определения специфической фармакологической активности лекарствен-

ных средств биологическими методами».

Определение активности ферментных препаратов в сравнении со стандартным образцом

С целью снижения погрешности методов определения ферментативной активности необходимо проводить определение ферментативной активности препарата в сравнении со стандартным образцом данного фермента.

Определение ферментативной активности испытуемого препарата и стандартного образца проводят в одинаковых условиях опыта.

Активность препарата (А ) в соответствующих единицах (МЕ или ЕД)

вычисляют по формуле:

П – величина измеряемого параметра для испытуемого препарата;

К – коэффициент, выравнивающий концентрации растворов испытуемого препарата и стандартного образца.

Определение активности иммобилизованных ферментов

Иммобилизованными называются ферменты, молекулы которых физи-

чески или химически связаны с каким-либо носителем. В качестве носителей

могут быть использованы природные и синтетические полимеры, органиче-

ские низкомолекулярные носители, неорганические материалы. В зависимо-

сти от природы носителя иммобилизованные ферменты могут существовать в форме гелей, пленок, гранул, макропористых порошк ов и в других формах.

Активность иммобилизованных ферментов может нормироваться на массу носителя или его площадь.

Кинетические характеристики иммобилизованных ферментов, числен-

но определяемые константой Михаэлиса К м и каталитической константойk кат , могут существенно измениться в зависимости от природы носителя и способа иммобилизации. Поэтому для корректного определения активности иммобилизованных ферментов необходим повторный подбор условий.

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИННОГО АЗОТА МЕТОДАМИ ФОРМОЛЬНОГО И ЙОДОМЕТРИЧЕСКОГО ТИТРОВАНИЯ

(ОФС 42-0091-08)

Определение азота свободных аминных групп в препаратах аминокис-

лот, пептидов, белков и других с содержанием азота 1,5–5,0 мг в 1 мл испы-

туемого раствора проводят методом формольного титрования (метод Серен-

сена), основанным на защите формальдегидом свободных аминогрупп (обра-

зование оснований Шиффа) и алкалиметрическом титровании эквивалентно-

го количества карбоксильных групп. Метод неприменим в присутствии ио-

нов аммония, завышающих результаты определения.

Определение аминного азота в препаратах с более низким его содержа-

нием (около 0,01–0,06 мг в 1 мл испытуемого раствора) проводят методом Попе-Стевенса. Метод основан на взаимодействии аминокислот в щелочном растворе с ионами двухвалентной меди и последующем йодометрическом титровании.

Метод формольного титрования (метод Серенсена)

К точной навеске или точному объему (указывают в частной фармако-

пейной статье) испытуемого образца прибавляют воду до объема 20 мл. При необходимости раствор нейтрализуют потенциометрически до рН 7,0, добав-

ляя 0,1 М раствор натрия гидроксида или 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты. По окончании нейтрализации добавляют от 2 до 10 мл (указывают в частной фармакопейной статье) раствора формальдегида 35 %, нейтрализо-

ванного в день анализа 10 % раствором натрия гидроксида до рН 7,0, пере-

мешивают и титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до знач ения рН 9,1,

не изменяющегося при перемешивании в течение 2 мин, или до появления слаборозового окрашивания (индикатор – 1 % раствор фенолфталеина).

Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида соответствует 1,4 мг аминного

Метод йодометрического титрования (метод Попе-Стевенса)

В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают точную навеску испы-

туемого образца, прибавляют 4 мл воды, 0,5 мл 0,1 % раствора тимолфталеи-

на, перемешивают и по каплям добавляют 0,5 М раствор натрия гидроксида до слабого голубого окрашивания. Прибавляют 20 мл суспензии меди фосфа-

та, перемешивают. При исчезновении осадка добавляют еще 5 мл суспензии меди фосфата, объем раствора в колбе доводят водой до метки, перемешива-

ют и фильтруют через плотный бумажный фильтр (синяя лента). Фильтрат должен быть прозрачным. Отбирают 10 мл фильтрата в коническую колбу,

прибавляют 0,4 мл уксусной кислоты ледяной, добавляют 7,5 мл 10 % рас-

твора калия йодида и выделившийся йод титруют 0,01 М раствором натрия тиосульфата. В конце титрования, когда раствор примет соломенно-желтую окраску, добавляют 1,5 мл раствора крахмала и продолжают титрование до исчезновения появившейся синей окраски.

Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,01 М раствора натрия тиосульфата соответствует 0,28 мг амин-

ного азота.

Примечания

1. Приготовление раствора меди(II) хлорида . В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 27,3 г меди(II) хлорида, растворяют в 500 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

2. Приготовление раствора натрия фосфата .

А) 68,5 г натрия фосфата додекагидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в 500 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают

или Б) 64,5 г натрия фосфата двузамещенного 12-водного помещают в мер-

ную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в 500 мл воды, освобожденной от углерода диоксида кипячением, прибавляют 7,2 г натрия гидроксида, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

3. Приготовление боратного буферного раствора . В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 28,6 г натрия тетрабората, растворяют в 750 мл воды, прибавляют 50 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (рН 8,8).

4. Приготовление суспензии меди фосфата . Смешивают 1 объем раствора меди(II) хлорида с 2 объемами раствора натрия фосфата и 2 объемами боратного буферного раствора.

Раствор готовят перед использованием.

А.В. Рогачёв, эксперт 1 категории, ВКФ РГП «КазИнМетр», г. Усть-Каменогорск

Рассмотрены основные положения валидации методик выполне ния измерений. Приведены статистические критерии валидации.

Валидация - одно из ключевых понятий в системе обеспечения качества результатов количественного химического анализа.

По определению, валидация – это подтверждение путем исследования и предоставления объективных доказательств того, что требования, предназначенные для конкретного использования или применения, выполняются. Одновременно для этой процедуры вместо термина «валидация» приме-

няется – «оценка пригодности методик». Широко развитый и адоптированный к химическому анализу аппарат математической статистики позволяет выполнить задачу «..подтверждение путем исследования и предоставления объективных доказательств…». Рассмотрим действия лаборатории в части валидации методик выполнения измерений (далее МВИ или методика). Аналитическая задача,

определяется исходя из требований заявителя.

Для решения поставленной задачи лаборатория должна подо-

брать методику из существующих и, в случае необходимости, модернизировать её.

При отсутствии соответствующей методики разработать новую.

При этом существующая МВИ должна быть ранее валидирована, в случае модернизации необходимо выполнить процедуру валидации в части изменённых параметров МВИ, в случае разработки новой методики процесс ее аттестации и валидации совпадают (рисунок 1).

На этапах отбора проб, подготовки проб, взятия аликвот и других отделяется часть материала для дальнейшей работы. С точки зрения математической статистики выполняется выборка из генеральной совокупности. Где полученный материал (проба, навеска, аликвота) является выборкой , а весь материал, из которого она получена, представляет генеральную совокупность . Характеристики этой выборки, такие как: математическое ожидание, дисперсия, среднее квадратическое отклонение (СКО) и другие, являются оценками соответствующих характеристик генеральной совокупности. Для аналитических измерений наиболее часто

это оценка среднего содержания аналита.

Понятие оценка является ключевым в теории математической статистики. Оценку можно рассматривать как приближение к соответствующим характеристикам генеральной совокупности. Качество полученных оценок генеральной совокупности зависит от многих параметров, таких как объем выборки, представительность выборки и др. Рассматривая МВИ как статистический инструмент, логично оценивать качество данного инструмента. Качество измерений может быть охарактеризовано следующими параметрами: правильность, прецизионность, линейность, предел обнаружения, предел количественного определения, специфичность устойчивость. Эти параметры являются одновременно и метрологическими характеристиками методики и критериями проведения процедуры валидации.

Возможны и другие характеристики для конкретной методики или оборудования. Валидация МВИ в общем случае – это определение или подтверждение указанных характеристик. Рассмотрим их подробнее.

Правильность аналитического метода – степень близости среднего значения, полученного на основании большой серии результатов измерений к принятому опорному значению. Оценка правильности может быть выполнена несколькими способами: анализ стандартных образцов или образцов сравнения; сравнение результатов с результатами методики сравнения; оценка методом добавок; оценка методом варьирования навески.

Каждый из указанных способов с описанием алгоритмов рассмотрен в , ...

Прецизионность – близость между независимыми результатами измерений, полученными при определенных условиях. В предельных значениях условий проведения испытаний прецизионность может называться повторяемостью или воспроизводимостью. Основным методом оценки данного параметра является обработка данных многократных измерений идентичных проб.

Исследования должны охватывать весь диапазон измерений МВИ. Целесообразно процедуру оценки прецизионности совмещать с проведением внутри лабораторного контроля. Алгоритмы рассмотрены в , .

Линейность аналитического

метода – показатель того, что результаты измерений являются непосредственно или посредством четких математических преобразований пропорциональными концентрации аналита в образцах в пределах данного диапазона. Часто линейность оценивается графически в добавление к математической оценке или как альтернатива ей. Методы определения линейности описаны .

Предел обнаружения – минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть обнаружена, но не определена количественно в условиях анализа, по-другому – это точка, в которой измеренная величина больше, чем неопределённость, связанная с ней.

При валидации, как правило, достаточно приблизительной оценки значения этого уровня. Часто применяется подход «3􀄱 », т. е. пределом обнаружения считается сигнал, в три раза превышающий стандартное отклонение фонового сигнала.

Предел количественного определения – минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть определена с приемлемой точностью в условиях анализа. Алгоритмы оценки пределов обнаружения и определения рассмотрены в . Специфичность – . Нормативные документы определяют специфичность аналитического метода как его способность измерить точно аналит в присутствии мешающих веществ, которые могут ожидаться в матрице образца. Специфичность – одна из важнейших характеристик хроматографических и спектральных методов.

Устойчивость (робастность) . В испытаниях устойчивости исследуют влияние операционных параметров на результаты анализа. Для определения устойчивости метода ряд параметров (например, скорость потока, температура колонки, объем ввода пробы, длина волны детектирования и др.) изменяют в пределах реального диапазона и определяют количественное влияние этих переменных.

Валидация МВИ путем межлабораторного эксперимента наиболее объективный метод, который позволяет считать МВИ робастной (устойчивой). Использование таких МВИ (такие МВИ могут быть опубликованы в качестве «СТ РК…», «ГОСТ…» или других стандартных процедур) облегчает нагрузку на лабораторию . Планирование эксперимента по валидации следует проводить с учетом целесообразности определения тех или иных характеристик. В таблице 1 отражен пример такого выбора*.

Заключение

Не существует универсального алгоритма для выполнения валидации. Валидация может включать в себя как оценку всех метрологических характеристик МВИ, так и частичную оценку, в случае модернизации действующей МВИ. При планировании эксперимента по валидации МВИ аналитик самостоятельно определяет критерии валидации, используя в качестве инструментов статистические алгоритмы. Аналитик составляет программу валидации для заданной МВИ в заданных условиях. Правильно расставляя приоритеты, можно объединять работы по валидации с разработкой МВИ, с оценкой неопределённости измерений и внутрилабораторным контролем показателей качества МВИ.

Литература

1. СТ РК ИСО/МЭК 17025–2007 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».

2. ГОСТ ИСО/МЭК 17025–2009 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».

КОЛЛЕГИЯ

РЕШЕНИЕ

В соответствии со статьей 30 Договора о Евразийском экономическом союзе от 29 мая 2014 года и пунктом 2 статьи 3 Соглашения о единых принципах и правилах обращения лекарственных средств в рамках Евразийского экономического союза от 23 декабря 2014 года Коллегия Евразийской экономической комиссии

решила:

1. Утвердить прилагаемое Руководство по валидации аналитических методик проведения испытаний лекарственных средств.

2. Настоящее Решение вступает в силу по истечении 6 месяцев с даты его официального опубликования.

Председатель Коллегии
Евразийской экономической комиссии
Т.Саркисян

Руководство по валидации аналитических методик проведения испытаний лекарственных средств

УТВЕРЖДЕНО
Решением Коллегии
Евразийской экономической комиссии
от 17 июля 2018 года N 113

I. Общие положения

1. В настоящем Руководстве определяются правила валидации аналитических методик проведения испытаний лекарственных средств, а также перечень характеристик, подлежащих оценке при валидации указанных методик и включению в регистрационные досье, подаваемые в уполномоченные органы государств - членов Евразийского экономического союза (далее соответственно - государства-члены, Союз).

2. Целью валидации аналитической методики проведения испытаний лекарственных средств является документированное подтверждение ее пригодности для целевого назначения.

II. Определения

3. Для целей настоящего Руководства используются понятия, которые означают следующее:

"аналитическая методика" (аnalytical procedure) - методика проведения испытаний лекарственных средств, которая включает в себя подробное описание последовательности действий, необходимых для выполнения аналитического испытания (в том числе описание подготовки испытуемых образцов, стандартных образцов, реактивов, использования оборудования, построения градуировочной кривой, используемых расчетных формул и т.д.);

"воспроизводимость" (reproducibility) - свойство, характеризующее прецизионность в межлабораторных испытаниях;

"диапазон применения (аналитическая область)" (range) - интервал между наибольшей и наименьшей концентрациями (количеством) определяемого вещества в образце (включая эти концентрации), для которого показано, что аналитическая методика имеет приемлемый уровень прецизионности, правильности и линейности;

"линейность" (linearity) - прямо пропорциональная зависимость аналитического сигнала от концентрации (количества) определяемого вещества в образце в пределах диапазона применения (аналитической области) методики;

"открываемость (извлекаемость)" (recovery) - соотношение между полученным средним и истинным (опорным) значениями с учетом соответствующих доверительных интервалов;

"повторяемость (прецизионность внутри методики)" (repeatability (intra-assay precision)) - прецизионность методики при выполнении повторных испытаний в одинаковых рабочих условиях (например, одним и тем же аналитиком или группой аналитиков, на одном и том же оборудовании, с одними и теми же реактивами и т.д.) в течение короткого промежутка времени;

"правильность" (accuracy, trueness) - близость между принятым истинным (опорным) значением и полученным значением, которая выражается величиной открываемости;

"предел количественного определения" (quantitation limit) - наименьшее количество вещества в образце, которое можно количественно определить с соответствующей прецизионностью и правильностью;

"предел обнаружения" (detection limit) - наименьшее количество определяемого вещества в образце, которое может быть обнаружено, но необязательно точно количественно определено;

"прецизионность" (precision) - выражение близости (степени разброса) результатов (значений) между сериями измерений, проведенных на множестве проб, взятых из одной и той же однородной пробы, в предписанных методикой условиях;

"промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность" (intermediate precision) - влияние вариаций внутри лаборатории (разные дни, разные аналитики, разное оборудование, разные серии (партии) реактивов и т.д.) на результаты испытаний идентичных образцов, отобранных из одной и той же серии;

"специфичность" (specificity) - способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество независимо от других веществ (примеси, продукты деградации, вспомогательные вещества, матрица (среда) и др.), присутствующих в испытуемом образце;

"устойчивость (робастность)" (robustness) - способность аналитической методики быть устойчивой к влиянию небольших задаваемых изменений в условиях проведения испытания, которая указывает на ее надежность при обычном (стандартном) использовании.

III. Типы аналитических методик, подлежащих валидации

4. В настоящем Руководстве рассматриваются подходы к валидации 4 наиболее распространенных типов аналитических методик:

а) испытания на идентификацию (подлинность);

б) испытания для определения количественного содержания примесей (quantitative tests for impurities content);

в) испытания для определения предельного содержания примесей в пробе (limit tests for the control impurities);

г) количественные испытания (на содержание или активность) (quantitative tests of the active moiety) для определения активной части молекулы действующего вещества в испытуемом образце.

5. Все аналитические методики, используемые для контроля качества лекарственных средств, необходимо валидировать. В настоящем Руководстве не рассматривается валидация аналитических методик для видов испытаний, не включенных в пункт 4 настоящего Руководства (например, испытания на растворение или определение размера частиц (дисперсности) фармацевтической субстанции и др.).

6. Испытания на идентификацию (подлинность) заключаются, как правило, в сравнении свойств (например, спектральных характеристик, хроматографического поведения, химической активности и т.д.) испытуемого и стандартного образцов.

7. Испытания для определения количественного содержания примесей и испытания для определения предельного содержания примесей в пробе направлены на правильное описание показателей чистоты пробы. Требования к валидации методик количественного определения примесей отличаются от требований к валидации методик определения предельного содержания примесей в пробе.

8. Методики количественных испытаний направлены на измерение содержания определяемого вещества в испытуемом образце. В настоящем Руководстве под количественным определением понимается количественное измерение основных компонентов фармацевтической субстанции. Сходные валидационные параметры применимы в отношении количественного определения действующего вещества или других компонентов лекарственного препарата. Допускается использовать валидационные параметры количественного определения в других аналитических методиках (например, при испытании на растворение).

Назначение аналитических методик должно быть четко определено, так как от этого зависит выбор валидационных характеристик, которые должны быть оценены в ходе валидации.

9. Оценке подлежат следующие типичные валидационные характеристики аналитической методики:

а) правильность (accuracy (trueness));

б) прецизионность (precision):

повторяемость (repeatability);

промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность (intermediate precision);

в) специфичность (specificity);

г) предел обнаружения (detection limit);

д) предел количественного определения (quantitation limit);

е) линейность (linearity);

ж) диапазон применения (аналитическая область) (range).

10. Наиболее важные валидационные характеристики для валидации различных типов аналитических методик приведены в таблице.

Таблица. Валидационные характеристики для валидации различных типов аналитических методик

________________
* Если определена воспроизводимость, определение промежуточной прецизионности не требуется.

** Недостаточная специфичность одной аналитической методики может быть компенсирована использованием одной или нескольких дополнительных аналитических методик.

*** Может потребоваться в некоторых случаях (например, когда предел обнаружения и нормируемый предел содержания определяемой примеси близки).

Примечание. "-" - характеристика не оценивается, "+" - характеристика оценивается.


Указанный перечень следует рассматривать как типовой при валидации аналитических методик. Возможны исключения, требующие отдельного обоснования производителем лекарственного средства. Такая характеристика аналитической методики, как устойчивость (робастность), не приведена в таблице, но ее следует рассматривать на соответствующем этапе разработки аналитической методики.

Повторная валидация (ревалидация) может быть необходима в следующих случаях (но не ограничивается ими):

изменение схемы синтеза фармацевтической субстанции;

изменение состава лекарственного препарата;

изменение аналитической методики.

Повторная валидация не проводится, если производителем представлено соответствующее обоснование. Объем повторной валидации зависит от характера внесенных изменений.

IV. Методология валидации аналитических методик

1. Общие требования к методологии валидации аналитических методик

11. В настоящем разделе приведены характеристики, учитываемые при валидации аналитических методик, а также представлены некоторые подходы и рекомендации для установления различных валидационных характеристик каждой аналитической методики.

12. В некоторых случаях (например, при доказательстве специфичности) для обеспечения качества фармацевтической субстанции или лекарственного препарата может быть использовано сочетание нескольких аналитических методик.

13. Необходимо представить и проанализировать все соответствующие данные, собранные в ходе валидации, и формулы, использованные для расчета валидационных характеристик.

14. Допускается использовать иные подходы, чем подходы, изложенные в настоящем Руководстве. За выбор процедуры и протокола валидации несет ответственность заявитель. При этом основная цель валидации аналитической методики состоит в подтверждении пригодности методики для целевого назначения. Ввиду своей сложности подходы к аналитическим методикам для биологических и биотехнологических препаратов могут отличаться от описанных в настоящем Руководстве.

15. На протяжении всего исследования валидационных характеристик следует использовать стандартные образцы с известными характеристиками, подтвержденными документально. Необходимая степень чистоты стандартных образцов зависит от целевого назначения.

16. В отдельных подразделах настоящего раздела рассматриваются различные валидационные характеристики. Структура настоящего раздела отражает ход процесса разработки и оценки аналитической методики.

17. Экспериментальную работу следует планировать таким образом, чтобы соответствующие валидационные характеристики изучить одновременно, получая надежные данные о возможностях аналитической методики (например, о специфичности, линейности, диапазоне применения, правильности и прецизионности).

2. Специфичность

18. Изучение специфичности необходимо осуществлять в ходе валидации испытаний на идентификацию, примеси и количественное определение. Процедуры подтверждения специфичности зависят от целевого назначения аналитической методики.

19. Способ подтверждения специфичности зависит от задач, для решения которых предназначена данная аналитическая методика. Не во всех случаях удается подтвердить, что аналитическая методика специфична в отношении данного определяемого вещества (полная избирательность). В этом случае рекомендуется использовать сочетание 2 и более аналитических методик.

Недостаточная специфичность одной аналитической методики может быть компенсирована использованием одной или нескольких дополнительных аналитических методик.

20. Специфичность для различных видов испытаний означает следующее:

а) при испытании на идентификацию - подтверждение того, что методика позволяет идентифицировать именно определяемое вещество;

б) при испытании на примеси - подтверждение того, что методика позволяет правильно распознать примеси в образце (например, испытание на родственные соединения, тяжелые металлы, содержание остаточных растворителей и т.д.);

в) при количественных испытаниях - подтверждение того, что методика позволяет установить содержание или активность именно определяемого вещества в образце.

Идентификация

21. Удовлетворительные испытания на идентификацию должны обладать способностью различать между собой структурно близкородственные соединения, которые могут присутствовать в пробе. Избирательность аналитической методики может быть подтверждена путем получения положительных результатов (возможно, путем сравнения с известным стандартным образцом) для образцов, содержащих определяемый компонент, и отрицательных результатов для образцов, не содержащих его.

22. Для подтверждения отсутствия ложноположительных результатов испытание на идентификацию может быть проведено для веществ с близким строением или веществ, сопутствующих определяемому веществу.

23. Выбор потенциально мешающих проведению испытания веществ должен быть обоснован.

Количественное определение и испытания на примеси

24. При подтверждении специфичности для аналитической методики с использованием метода хроматографического разделения следует представлять репрезентативные хроматограммы с надлежащим указанием индивидуальных компонентов. Необходимо использовать аналогичные подходы к другим методикам, основанным на разделении.

25. Критичные разделения в хроматографии подлежат изучению на соответствующем уровне. В случае критичных разделений должна быть установлена величина разрешения 2 наиболее близко элюируемых компонентов.

26. При использовании неспецифического метода количественного определения следует применять дополнительные аналитические методики и подтверждать специфичность всего комплекса методик. Например, если при выпуске фармацевтической субстанции количественное определение проводится титриметрическим методом, можно его дополнить соответствующим испытанием на примеси.

27. Подход аналогичен как для количественного определения, так и для испытаний на примеси.

Наличие образцов примесей

28. При наличии образцов примесей определение специфичности аналитической методики состоит в следующем:

а) при количественном определении необходимо подтвердить избирательность определения вещества в присутствии примесей и (или) других компонентов образца. Практически это осуществляется путем добавления к образцу (фармацевтической субстанции или лекарственному препарату) примесей и (или) вспомогательных веществ в соответствующем количестве и при наличии доказательства отсутствия их влияния на результат количественного определения действующего вещества;

б) при испытаниях на примеси специфичность может быть установлена путем добавления в фармацевтическую субстанцию или лекарственный препарат примесей в определенных количествах и при наличии доказательства разделения этих примесей друг от друга и (или) от других компонентов образца.

Отсутствие образцов примесей

29. Если стандартные образцы примесей или продуктов деградации отсутствуют, специфичность можно подтвердить путем сравнения результатов испытаний проб, содержащих примеси или продукты деградации, с результатами другой валидированной методики (например, фармакопейной или иной валидированной аналитической (независимой) методики). В соответствующих случаях стандартные образцы примесей должны включать в себя пробы, подвергшиеся хранению в определенных стрессовых условиях (свет, нагревание, влажность, кислотный (основный) гидролиз и окисление).

30. В случае количественного определения необходимо сравнить 2 результата.

31. В случае испытаний на примеси необходимо сравнить профили примесей.

32. Для доказательства соответствия пика определяемого вещества только одному компоненту целесообразно провести исследования на чистоту пиков (например, использование диодно-матричного детектирования, масс-спектрометрии).

3. Линейность

33. Линейную зависимость необходимо оценить в пределах всего диапазона применения аналитической методики. Ее можно подтвердить напрямую на фармацевтической субстанции (путем разведения основного стандартного раствора) и (или) на отдельных навесках искусственных (модельных) смесей компонентов лекарственного препарата, используя предложенную методику. Последний аспект допускается изучить в ходе определения диапазона применения (аналитической области) методики.

34. Линейность оценивается визуально по графику зависимости аналитического сигнала как функции от концентрации или количества определяемого вещества. При наличии четкой линейной зависимости полученные результаты необходимо обработать подходящими статистическими методами (например, путем вычисления регрессионной линии методом наименьших квадратов). Для получения линейности между результатами количественного определения и концентрациями проб до проведения регрессионного анализа может потребоваться математическое преобразование результатов испытаний. Результаты анализа линии регрессии могут быть использованы для математической оценки степени линейности.

35. При отсутствии линейности данные испытаний следует подвергнуть математическому преобразованию до проведения регрессионного анализа.

36. Для подтверждения линейности должны быть определены и представлены коэффициент корреляции или коэффициент детерминации, свободный член линейной регрессии, тангенс угла наклона линии регрессии и остаточная сумма квадратов отклонений, а также приложен график со всеми экспериментальными данными.

37. Если линейность не наблюдается ни при каких видах математических преобразований (например, при валидации иммуноаналитических методик), аналитический сигнал необходимо описать с помощью соответствующей функции концентрации (количества) определяемого компонента в пробе.

V. Диапазон применения (аналитическая область)

39. Диапазон применения аналитической методики зависит от ее назначения и определяется при изучении линейности. В пределах диапазона применения методика должна обеспечивать требуемую линейность, правильность и прецизионность.

40. В качестве минимально допустимых должны быть рассмотрены следующие диапазоны применения (аналитические области) аналитических методик:

а) для количественного определения действующего вещества в фармацевтической субстанции или лекарственном препарате - от концентрации (содержания) 80 процентов до концентрации (содержания) 120 процентов от номинальной концентрации (содержания);

б) для однородности дозирования - от концентрации (содержания) 70 процентов до концентрации (содержания) 130 процентов, если для лекарственного препарата не обоснован более широкий диапазон в зависимости от лекарственной формы (например, дозированные ингаляторы);

в) для испытания на растворение - ±20 процентов (абсолютных) от номинального диапазона применения. Например, если спецификации препарата с модифицированным высвобождением охватывают область от 20 процентов за первый час до 90 процентов от заявленного содержания за 24 часа, валидированный диапазон применения должен быть от 0 до 110 процентов от заявленного содержания;

г) для определения примесей - от предела обнаружения примеси до 120-процентного значения, указанного в спецификации;

д) для примесей, обладающих чрезвычайно сильным действием или имеющих токсический или непредвиденный фармакологический эффект, предел обнаружения и предел количественного определения должны быть соразмерны тому уровню, на котором эти примеси должны контролироваться. В целях валидации методик испытания на примеси, применяемых в ходе разработки, может потребоваться задать аналитическую область вблизи предполагаемого (возможного) предела;

е) если количественное определение и чистота изучаются одновременно с помощью одного испытания и используется только 100-процентный стандарт, линейная зависимость должна быть во всем диапазоне применения аналитической методики начиная с порога информирования для примеси (в соответствии с правилами изучения примесей в лекарственных средствах и установления требований к ним в спецификациях, утверждаемыми Евразийской экономической комиссией) до 120-процентного содержания, указанного в спецификации для количественного определения.

VI. Правильность

41. Правильность должна быть установлена для всего диапазона применения аналитической методики.

1. Количественное определение активной фармацевтической субстанции

Фармацевтическая субстанция

42. Могут быть использованы несколько способов оценки правильности:

применение аналитической методики к анализируемой субстанции с известной степенью чистоты (например, к стандартному материалу);

сравнение результатов анализа, полученных с использованием валидируемой аналитической методики, и результатов, полученных с помощью методики, правильность которой известна, и (или) независимой методики.

Заключение о правильности можно сделать после установления прецизионности, линейности и специфичности.

Лекарственный препарат

43. Могут быть использованы несколько способов оценки правильности:

применение аналитической методики к искусственным (модельным) смесям компонентов лекарственного препарата, в которые было добавлено заранее известное количество определяемого вещества;

при отсутствии образцов всех компонентов лекарственного препарата возможно добавление заранее известного количества фармацевтической субстанции к лекарственному препарату или сравнение результатов, полученных с помощью другой методики, правильность которой известна, и (или) независимой методики.

Заключение о правильности можно сделать после определения прецизионности, линейности и специфичности.

2. Количественное определение примесей

44. Правильность определяется на пробах (фармацевтической субстанции и лекарственного препарата), в которые добавлено известное количество примесей.

45. При отсутствии образцов определяемых примесей и (или) продуктов деградации приемлемо сравнение результатов с результатами, полученными с помощью независимой методики. Допускается использование аналитического сигнала действующего вещества.

46. Необходимо указать конкретный способ выражения содержания индивидуальных примесей или их суммы (например, в массовых процентах или в процентах по отношению к площади пика, но во всех случаях по отношению к основному определяемому веществу).

47. Правильность оценивается не менее чем для 9 определений 3 различных концентраций, охватывающих весь диапазон применения (то есть 3 концентрации и 3 повтора для каждой концентрации). Определения должны включать в себя все стадии методики.

48. Правильность выражается величиной открываемости в процентах по результатам количественного определения вещества, добавленного в известном количестве в анализируемый образец, или разностью между полученным средним и истинным (опорным) значениями с учетом соответствующих доверительных интервалов.

VII. Прецизионность

49. Валидация испытаний на количественное определение и примеси предусматривает определение прецизионности.

50. Прецизионность устанавливается на 3 уровнях: повторяемость, промежуточная прецизионность и воспроизводимость. Прецизионность следует устанавливать с использованием однородных аутентичных образцов. В случае невозможности получения однородного образца допускается определение прецизионности с помощью искусственно приготовленных (модельных) образцов или раствора образца. Прецизионность аналитической методики, как правило, выражается величиной дисперсии, стандартного отклонения или коэффициента вариации серии измерений.

VIII. Повторяемость

51. Повторяемость определяется путем выполнения не менее 9 определений концентраций, входящих в диапазон применения аналитической методики (3 концентрации и 3 повтора для каждой концентрации), или не менее 6 определений концентрации для образцов со 100-процентным содержанием определяемого вещества.

IX. Промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность

52. Степень установления промежуточной прецизионности зависит от условий использования аналитической методики. Заявитель должен установить влияние случайных факторов на прецизионность аналитической методики. Типичными исследуемыми (вариабельными) факторами являются разные дни, аналитики, оборудование и т.д. Изучать указанные влияния по отдельности не требуется. При изучении влияния различных факторов предпочтительно использовать планирование эксперимента.

X. Воспроизводимость

53. Воспроизводимость характеризует прецизионность в межлабораторном эксперименте. Воспроизводимость следует определять в случае стандартизации аналитической методики (например, при ее включении в Фармакопею Союза или в фармакопеи государств-членов). Включение данных о воспроизводимости в регистрационное досье не требуется.

XI. Представление данных

54. Для каждого вида прецизионности необходимо указывать стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации) и доверительный интервал.

XII. Предел обнаружения

55. Возможны различные подходы к определению предела обнаружения в зависимости от того, является методика инструментальной или неинструментальной. Допускается использовать и другие подходы.

XIII. Визуальная оценка

56. Визуальная оценка может использоваться как для неинструментальных, так и для инструментальных методик. Предел обнаружения устанавливается путем анализа проб с известными концентрациями определяемого вещества и определения его минимального содержания, при котором оно достоверно обнаруживается.

XIV. Оценка предела обнаружения по отношению "сигнал/шум"

57. Данный подход применим только к аналитическим методикам, для которых наблюдается шум базовой линии.

58. Определение отношения "сигнал/шум" проводится методом сравнения сигналов, полученных от проб с известными низкими концентрациями, с сигналами, полученными от холостых проб, и установления минимальной концентрации, при которой определяемое вещество может быть достоверно обнаружено. Для оценки предела обнаружения приемлемой считается величина отношения "сигнал/шум" от 3:1 до 2:1.

XV. Оценка предела обнаружения по стандартному отклонению аналитического сигнала и наклону градуировочной кривой

59. Предел обнаружения (ПО) может быть выражен следующим образом:

где:

60. Значение k вычисляется из градуировочной кривой для определяемого вещества. Оценка s может осуществляться несколькими способами:

б) по градуировочной кривой. Следует проанализировать полученную градуировочную кривую, построенную для образцов с содержанием определяемого вещества, близким к пределу обнаружения. В качестве стандартного отклонения может быть использовано остаточное стандартное отклонение регрессионной прямой или стандартное отклонение точки пересечения с осью ординат (стандартное отклонение свободного члена линейной регрессии).

XVI. Представление данных

61. Необходимо указать предел обнаружения и метод его определения. Если определение предела обнаружения основывается на визуальной оценке или оценке отношения "сигнал/шум", представление соответствующих хроматограмм считается достаточным для его обоснования.

62. Если значение предела обнаружения получено путем расчета или экстраполяции, оценка должна быть подтверждена посредством независимого испытания достаточного количества образцов с содержанием определяемого вещества, соответствующим пределу обнаружения или близкому к нему значению.

XVII. Предел количественного определения

63. Предел количественного определения является необходимой валидационной характеристикой методик, используемых для определения низкого содержания веществ в образце, в частности для определения примесей и (или) продуктов деградации.

64. Возможно несколько подходов к определению предела количественного определения в зависимости от того, является методика инструментальной или неинструментальной. Допускается использовать другие подходы.

XVIII. Визуальная оценка

65. Визуальная оценка может использоваться как для неинструментальных методик, так и для инструментальных.

66. Предел количественного определения обычно устанавливается путем анализа проб с известными концентрациями определяемого вещества и оценки минимального содержания, при котором определяемое вещество поддается количественному определению с приемлемой правильностью и прецизионностью.

XIX. Оценка предела количественного определения по отношению "сигнал/шум"

67. Данный подход применим только к методам измерений, при которых наблюдается шум базовой линии.

68. Определение отношения "сигнал/шум" проводится методом сравнения измеряемых сигналов, полученных от образцов с известными низкими концентрациями определяемого вещества, с сигналами, полученными от холостых проб, и установления минимальной концентрации, при которой определяемое вещество может быть достоверно определено количественно. Обычное отношение "сигнал/шум" составляет 10:1.

ХХ. Оценка предела количественного определения по стандартному отклонению сигнала и наклону градуировочной кривой

69. Предел количественного определения (ПКО) может быть выражен следующим образом:

где:

s - стандартное отклонение аналитического сигнала;

k - тангенс угла наклона градуировочной кривой.

70. Значение k вычисляется из градуировочной кривой для определяемого вещества. Оценка s может осуществляться несколькими способами:

а) по стандартному отклонению холостой пробы. Измеряется величина аналитического сигнала для достаточного количества холостых проб, и рассчитывается стандартное отклонение их значений;

б) по градуировочной кривой. Следует проанализировать полученную градуировочную кривую, построенную для образцов с содержанием определяемого вещества, близким к пределу количественного определения. В качестве стандартного отклонения может быть использовано остаточное стандартное отклонение регрессионной прямой или стандартное отклонение точки пересечения с осью ординат (стандартное отклонение свободного члена линейной регрессии).

XXI. Представление данных

71. Необходимо указать предел количественного определения и метод его определения.

72. Предел количественного определения необходимо впоследствии подтвердить с помощью анализа достаточного числа проб с содержанием определяемого вещества, равным пределу количественного определения или близкому к нему значению.

73. Могут быть приемлемы и другие подходы, отличающиеся от перечисленных выше.

XXII. Устойчивость (робастность)

74. Изучение устойчивости (робастности) необходимо осуществлять на стадии разработки, объем исследований зависит от рассматриваемой аналитической методики. Необходимо показать надежность анализа при преднамеренных вариациях параметров (условий) методики.

75. Если результаты измерений зависят от изменений в условиях применения аналитической методики, необходимо строго контролировать соблюдение таких условий или оговорить меры предосторожности при проведении испытания.

76. В целях обеспечения поддержания валидности аналитической методики при ее использовании одним из последствий изучения устойчивости (робастности) должно стать установление серий параметров пригодности системы (например, испытание на разрешение (resolution test)).

77. Общими вариациями параметров являются:

стабильность растворов, используемых в аналитических методиках;

время экстрагирования.

Параметрами вариации для жидкостной хроматографии являются:

изменение рН подвижной фазы;

изменение состава подвижной фазы;

разные колонки (разные серии и поставщики);

температура;

скорость подвижной фазы (скорость потока).

Параметрами вариации для газовой хроматографии являются:

различные колонки (разные серии и поставщики);

температура;

скорость газа-носителя.

XXIII. Оценка пригодности системы

78. Оценка пригодности системы является неотъемлемой частью многих аналитических методик. Эти испытания основаны на концепции, что оборудование, электронная техника, аналитические операции и анализируемые образцы составляют целостную систему и требуют оценки в качестве таковой. Критерии пригодности системы должны быть установлены для конкретной методики и зависят от типа валидируемой аналитической методики. Дополнительную информацию можно получить в Фармакопее Союза или в фармакопеях государств-членов.



Электронный текст документа
подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальный сайт
Евразийского экономического союза
www.eaeunion.org, 20.07.2018